Egészség és a Betegség
1. Ko-immunoprecipitáció (Co-IP) :A Co-IP egy széles körben használt technika a fehérje-fehérje kölcsönhatások tanulmányozására. Ez magában foglalja egy fehérje (csalifehérje) immunprecipitációját egy sejtlizátumból egy, a csalifehérjére specifikus antitest segítségével. Az immunprecipitált fehérjekomplexet ezután elemzik, hogy azonosítsanak más fehérjéket (zsákmányfehérjék), amelyek kölcsönhatásba lépnek a csalifehérjével. A Co-IP-t különféle downstream elemzési módszerekkel lehet követni, mint például Western-blot, tömegspektrometria vagy immunfluoreszcens festés.
2. Lehúzó vizsgálatok :A pull-down vizsgálatok az affinitáskromatográfia elvén alapulnak. A csalifehérjét szilárd hordozón (például mágneses gyöngyökön vagy agaróz gyantán) rögzítik kovalens kötéssel vagy címkével (például GST vagy His-tag) való fúzióval. A sejtlizátumot vagy a tisztított fehérjekeveréket ezután az immobilizált csalifehérjével inkubáljuk. A nem kötött fehérjék eltávolítása céljából történő mosás után a kölcsönhatásba lépő fehérjéket (zsákmányfehérjéket) eluálják és elemzik.
3. Fluoreszcencia-rezonancia energiatranszfer (FRET) :A FRET egy olyan technika, amely két egymáshoz közel elhelyezkedő fluorofor (donor és akceptor) közötti energiaátvitelt méri. Ha a donor és az akceptor fluoroforok közel vannak egymáshoz (tipikusan 10-100 Å között), a donor fluorofor gerjesztése az akceptor fluorofor fénykibocsátását eredményezi. Ez az energiaátadás számszerűsíthető és felhasználható a fehérje-fehérje kölcsönhatások nyomon követésére. A FRET különféle módokon valósítható meg, beleértve a fehérjék specifikus fluoroforokkal való jelölését vagy genetikailag kódolt fluoreszcens fehérjék (például GFP és RFP) felhasználását.
4. Biomolekuláris kölcsönhatás elemzés (BIA) :A BIA, más néven felületi plazmonrezonancia (SPR) egy címkementes technika, amely a tárgylemez és az áramló folyadék határfelületén a törésmutató változását méri. Az egyik kölcsönhatásba lépő fehérje immobilizálva van az üvegfelületen, a másik fehérje pedig áthalad a felületen. A fehérjék közötti kölcsönhatás a törésmutató változásához vezet, ami kimutatható és számszerűsíthető. A BIA információkkal szolgálhat a fehérje-fehérje kölcsönhatások kötési affinitásáról és kinetikájáról.
5. Izotermikus titrálási kalorimetria (ITC) :Az ITC egy olyan technika, amely a két molekula közötti kölcsönhatáshoz kapcsolódó hőváltozást méri. Amikor a fehérjék kölcsönhatásba lépnek, hő szabadul fel (exoterm), vagy felszívódik (endoterm). Az ITC képes számszerűsíteni a fehérje-fehérje kölcsönhatások kötési affinitását (Kd) és termodinamikai paramétereit, például az entalpiaváltozást (ΔH) és az entrópiaváltozást (ΔS).
6. Protein Interaction Arrays :A fehérje-interakciós tömbök a fehérje-fehérje kölcsönhatások nagy áteresztőképességű szűrését foglalják magukban microarray formátumban. Különböző fehérjék vagy peptidek ezreit rögzítik egy szilárd felületre, és egy specifikus fehérje kötődését mutatják ki jelölt antitestek vagy más kimutatási módszerekkel. Ez a technika lehetővé teszi a fehérje-fehérje kölcsönhatások gyors és nagy léptékű elemzését.
7. Élesztő két-hibrid (Y2H) vizsgálat :Az Y2H vizsgálat egy genetikai módszer, amelyet élesztősejtekben a fehérje-fehérje kölcsönhatások azonosítására használnak. Ez magában foglalja két fehérje kódoló szekvenciájának fuzionálását egy transzkripciós faktor két különböző doménjéhez. Ha a két fehérje kölcsönhatásba lép, a transzkripciós faktor helyreáll, ami egy riportergén expressziójához vezet. A pozitív kölcsönhatásokat az élesztősejtek szelektív tápközegben vagy kolorimetriás vizsgálatokban történő növekedése alapján azonosítják.
A fehérje-fehérje kölcsönhatások tanulmányozására szolgáló módszer megválasztása a kérdéses specifikus fehérjéktől, a reagensek és berendezések elérhetőségétől, valamint a kívánt információszinttől függ. Ezen technikák kombinációi is használhatók a fehérje-fehérje kölcsönhatások átfogó betekintésére.