Optimális pH: A pepszinnek és a tripszinnek eltérő az optimális pH-tartománya katalitikus aktivitásukhoz. A pepszin savas körülmények között működik a legjobban, optimális pH-értéke 1,5-2,0, ami a gyomorban található. A tripszin viszont enyhén lúgos környezetben működik optimálisan, a vékonybélre jellemző 7,5-8,0 körüli optimális pH mellett.
Hőmérséklet: A pepszinnek és a tripszinnek különböző hőmérsékleti tartományai vannak, amelyeken belül maximális aktivitást mutatnak. A pepszin testhőmérsékleten (körülbelül 37 Celsius-fok) a legaktívabb, ami a gyomor belsejében lévő hőmérséklet. A tripszin azonban valamivel magasabb hőmérsékleten, 40-45 Celsius-fok körül a legaktívabb, ami megfelel a vékonybél hőmérsékletének.
Szubsztrát-specifikusság: A pepszinnek és a tripszinnek eltérő szubsztrátspecifitása van, ami azt jelenti, hogy elsősorban különböző típusú fehérjéket emésztenek. A pepszin főként a gyomorban lévő fehérjék kezdeti lebontásában vesz részt, és előnyben részesíti az aromás aminosavakat, például a fenilalanint, a tirozint és a triptofánt érintő peptidkötések felosztását. Ezzel szemben a tripszin tovább fejti ki hatását az emésztési folyamat során a vékonybélben, és specifikus a bázikus aminosavakat, például a lizint és az arginint tartalmazó peptidkötések elszakítására.
Ezek az optimális pH-, hőmérséklet- és szubsztrátspecifitásbeli különbségek biztosítják, hogy a pepszin és a tripszin szekvenciálisan és szelektíven hat a fehérjékre az emésztési folyamat során. A pepszin beindítja a fehérjék emésztését a gyomor savas környezetében, kisebb peptid fragmentumokra bontva azokat. Ahogy a gyomortartalom a vékonybélbe kerül, a pH-érték lúgosabbá válik, és a tripszin aktívvá válik. A tripszin tovább bontja a pepszin és más emésztőenzimek által generált peptid fragmentumokat, ami végül az aminosavak véráramba történő felszívódásához vezet.