Hogyan teszteljük a Nucleic Acids

tesztelése nukleinsavak végezzük orvosi diagnosztikában felderítése céljából patogének , például vírusok vagy baktériumok. Ezek a tesztek sokkal gyorsabb , és ezért lehetővé teszi az orvos számára , hogy a kezelés megkezdése a beteg, aki szokásosan kellett volna várni a fertőzés segítségével több hosszadalmas és fárasztó ellenanyag-alapú vizsgálati eljárásokban. A folyamat is ismert, mint egy nukleinsav amplifikációs teszt, és magában foglal egy módszert nevezik " reverz transzkriptáz - amplifikáció " polimeráz láncreakció. Mivel ez egy nagyon speciális tudományos eljárás , a fejlett tudás és szakértelem a molekuláris biológiai módszerek és az elmélet van szükség. Ez az, amire szüksége van
PCR csövek
PCR ütemadó
Pipetták és szűrő tippek
Gloves
Cells
Trizol vagy más RNS kivonása reagens
PCR puffer
Taq polimeráz
RT-PCR- primerek 1 mg /ml-es koncentráció
RN-áz -mentes vízben
dNTP
MgCI2
Véletlenszerű primerek 1,8 mg /ml koncentráció
SuperScript II reverz transzkriptáz

Show More utasítások
feldolgozása és előkészítése RNS
1

Harvest sejtek RNS kivonása reagens, például Trizol . 1 ml-es , elegendő ahhoz, hogy összegyűjtse a sejteket egy kút egy hat üregű szövettenyésztő lemez . A sejteket alaposan fel-le pipettázzuk , hogy homogenizáljuk őket, majd elvégzi az extrakciós eljárást leírtak a Trizol adatlapon. Röviden, kloroformmal extraháljuk , majd a centrifuga a fázisok elválasztására a DNS -, fehérje- és az RNS-t. Helyreállítása csak a színtelen RNS- szakasz és a csapadékot , hogy izopropanollal . Az inkubálás után , hogy a centrifugák és tisztítsák meg a kapott üledéket etanollal több mosás. Ezután a pelletet szuszpendáljuk újra RNáz -mentes vízben . Matton 2

reverz transzkripció, denaturálják pontosan 5 mikrogramm RNS 65 Celsius fok 10 mikroliter ( ul ) térfogata RNáz-mentes víz, majd gyorsan helyezze jégre. Minden reakció , össze 10 ul RNS , 3 ul 10X PCR- reakció- puffer , 2,5 ul 10 millimólos dNTP-ből, 6 liter 25 millimólos magnézium- klorid, 1 ul 1,8 random primerek koncentrációja milliliterenként milligramm , és 0,5 ul SuperScript II reverz transzkriptáz enzimet. Töltse fel mindegyik reakciót 17 ul RNáz -mentes víz . Inkubáljuk a csöveket szobahőmérsékleten tíz percig, majd 42 ° C egy óra hosszat , hogy a cDNS-t előállítani , akkor denaturálják 95 Celsius fok , és gyorsan , hogy a jég a reakció leállítására.
3

Ahhoz, hogy egy polimeráz láncreakció, ismét felállított egy reakcióelegy 0,5 ml-es csövekben kombinálásával 6 ul cDNS történt a reverz transzkripciós reakció , 1,5 ul 10X PCR-reakció -puffer, 0,2 ul Taq -polimeráz , 0,5 mikroliter reverz primert és szintén forward primert, majd a tetejét fel mindegyik csőbe 10,3 ul RNáz -mentes víz . Ahhoz, hogy futtatni a reakciók , létrehozott egy thermal cycler ( azaz olyan gép, amely elvégzi polimeráz láncreakció ) , 30 ciklusban az alábbiak szerint: 95 Celsius-fokon 0,5 percig denaturáljuk , majd 60 Celsius-fokon 45 másodpercig lágyítást , és végül 72 fok Celsius 1 percig , hogy kiterjesszék a szintetizált átirat .