Hogyan mérjük NADH

NAD és NADH egyaránt piridin nukleotidok részt az anyagcserében . NADH-t és NAD - enzimek együttes megtalálható a mitokondrium, az erőművek , a cellába. Mind és a NADH NAD részt vesznek , mint például a celluláris reakciók légzés és a fotoszintézis , ahol az energia és hidrogén keletkezik. És a NADH NAD üzemanyag biokémiai reakciókat , amelyek megkövetelik a számos enzim ATP-t termelni , a fő energiaforrás a sejtekben. Ez az, amire szüksége van
sejtek vagy szövetek vizsgált
NADH assay kit
foszfáttal pufferelt sóoldattal
Dry Ice
Fűtőblokk
96 lyukú plate
Centrifuga
jelölt csövek
Plate olvasó
Vortex
ismert koncentrációjú NADH

Show More utasítások
vizsgálat
1

Mossuk ki a sejtek vagy szövetek vizsgált hideg foszfát - pufferolt sóoldat, PBS-ben. Kivonat sejteket vagy szövetet szakítani extrakciós pufferben azáltal, hogy a keveréket a száraz jégen 20 percig, majd szobahőmérsékleten 10 percig keverjük. Ismételje meg .
2

Vortex 10 másodpercig . Spin egy centrifugában 5 percig ülepítése sejt vagy szövet törmeléket. Távolítsuk el a felülúszót, a folyékony fázis , és helyezzük a folyadékot egy tiszta csőbe .
3

szűrése felülúszó folyadékot egy speciális szűrőn , hogy távolítsa el az enzimek , amelyek lebontása NADH .
4

Vegyünk el 200 mikro- liter , tegyük egy tiszta csőbe , és át 60 Celsius fok hevítő blokkban 30 percig denaturálásához NAD . Hűvös és centrifuga , és távolítsa el a folyékony fázis . Transzfer 50 mikro liter egy 96 - lyukú lemez ; minden mintát kell a két vagy három példányban . Annak megállapításához, a teljes NAD , NADt , ne melegítse .
5

előkészítése és hozzá kerékpáros mix a 96 lyukú lemez . Keverjük össze és inkubáljuk 5 percig . Adjunk hozzá 10 mikro liter fejlesztő és hagyjuk inkubálódni szobahőmérsékleten legfeljebb 4 óra . Add egyablakos megoldást . Olvassa színváltozás a lemez olvasó, vagy fluoriméterrel attól függően, kit .
Kalibrációs görbe kiszámítása
6

készítsünk egy standard görbét azáltal, hogy egy ismert koncentrációjú NADH és hígítás az extrakciós pufferrel . Hígítsa különböző koncentrációkban , biztosítva a végén térfogata ugyanaz marad, mint vizsgálati minták . Plate ugyanazon a 96 lyukú lemez, mint vizsgálati minták . Olvassa el az optikai sűrűséget .
7

Döntetlen standard görbe grafikon koncentráció az X tengelyen és az optikai sűrűséget az Y tengelyen . Vegyünk egy átlagosan minden vizsgálati minta és olvassa el a koncentráció a kalibrációs görbe grafikon .
8

Számítsa ki a NAD /NADH arány kivonva teljes NAD , NADt , a NADH majd elosztják NADH .