Hogyan hajtsunk végre egy ELISA- vizsgálat

Egy ELISA , vagy enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálatban , egy biokémiai technikával végzett laboratóriumi kimutatására egy antigén ( mint például egy fehérje) vagy ellenanyag kísérleti mintában. Az assay kihasználja antitest antigénkötő - és fel lehet használni , hogy vizsgáljuk más sejt-és molekuláris kötési mechanizmusok is. Egy fehérje alapú ELISA vizsgálatban , egy "capture " ellenanyagot vagy fehérje előírt vizsgálati eljárásban edénybe, és lehetővé tette , hogy tartsák be az étel , ami után a "próba" anyag ( mint például az egyén proteinben) állapítja meg , és inkubáltuk a rögzítés ügynök. Miután több mosás , a " felismerés " antitestet adunk annak érdekében, hogy szemléltesse a jelenléte vagy hiánya , vagy ellenanyag-antigén kötő fehérje-fehérje . Ez az, amire szüksége van
Analitika edénybe ( például 96 lyukú blokk ) photo Capture antitestet ( hígítva 5 ug /ml 50 mM NaHCO2 , pH = 9,6 ) photo Szonda ellenanyag /fehérje (hígított különböző koncentrációk ) photo Detection ellenanyag (például a torma- peroxidáz -kapcsolt antitest ) photo PT -pufferrel ( 1x PBS, 0,05 százalék Tween -20 ) photo Blokkoló puffer (1x PBS-ben 5 mg /ml BSA-t, vagy 5 százalék lefölözött tej 1x PBS-ben)
Detection reagens ( pl. TMB reagens keverék)
Mechanikus laboratóriumi rázógép
hideg szobában vagy hűtőszekrényben
Pipetták és pipettahegyek és tippek

Show More utasítások

1

Hígítsuk befogó ellenanyag 5 ug /ml 50 mM NaHCO2 (pH = 9,6) . Adjunk hozzá 50 uL minden egyes lyukba a minta csészébe használni. Fedjük le a műanyag vagy alumínium , és inkubáljuk egy éjszakán át 4 ° C-on egy rázatón.
2

Billenő ki elfogó antitest és mossuk kétszer 200 uL PT pufferben. Adjunk hozzá 200 uL blokkoló puffert is ( PB vagy 5 százalék lefölözött tej) . Inkubáljuk bárhol két órán át rázás közben egy éjszakán át 4 ° C-on 3

Billenő ki blokkoló puffert és 4-szer mossuk 200 uL PT pufferben. Hozzáadás "próba" fehérje mintákat különböző koncentrációkban PB vagy 5 százalék lefölözött tej, hozzátéve 100 uL lyukanként. Inkubáljuk egy órán keresztül rázatva 4 ° C-on Billenő szondát ki megoldásokat, és hatszor mossuk 200 ul pufferben PT . Matton 4

hozzáadása kimutatási antitesttel ( HRP-vel konjugált ellenanyag) hígítottuk PB pufferben 1:4000 vagy 5 százalék lefölözött tej ( vagy az egyik , amely 0,05 százalék Tween -20), hozzáadunk 50 ul mintánként is. Inkubáljuk 30 perc és egy óra rázatás mellett 4 ° C-on 5

Billenő ki kimutatási antitest-oldat és 6-szor mossuk 200 ul puffert PT lyukanként , majd a mosást kétszer 200 ul 1x PBS-sel ( foszfáttal pufferolt sóoldat) . Billenő ki PBS-sel , és adjunk hozzá 100 uL kimutatási reagens per mérőhely ( HRP , használja frissen kevert TMB - reagens összekeverésével TMB- szubsztrát és-peroxid 1:1 ) . Inkubáljuk 15 percig szobahőmérsékleten , rázás alkalmanként.

Amikor a TMB- és HRP : Végül , adjunk hozzá 100 ul 1 M H3PO4 ( foszforsav ) lyukanként annak érdekében , hogy oltja a reakciót TBM .

olvasása lemez leolvasó segítségével mintát vizsgálunk , mint például egy 96 - lyukú lemez leolvasó . ( A HRP és a TMB , használja a " ELISA végpont vizsgálat " sablon áll rendelkezésre a legtöbb olvasó ).