Hogyan javíthatja a Három Fragment Ligation

kötése egy módszer a biológiai kutatások a csatlakozás külön DNS szálak . A folyamat egyszerűbbé vált a kereskedelmi forgalomban kapható lekötés készletek. A lekötés eljárás általában követi átalakulás, a folyamat beillesztése az egyesített DNS-t egy bakteriális vektorba címzett , a klón , és felerősítik a DNS-t. Összetettsége miatt a módszer , az eredmények gyakran nem felelnek meg a kívánt terméket és a szükséges hibaelhárítás . Ez még nagyobb jelentőséggel bír , hogy megpróbálja csatlakozzon több töredékek , mint például a hármas lekötés. Ez az, amire szüksége van
ligálása készlet
ligálása protokoll
agaróz gél
TBA 50 X puffer (242 g trisz bázis , 57,1 ml jégecet, 100 ml-es , 0,5 M EDTA-t 1 literre hígítjuk vízzel )
Ioncserélt víz
DNA tisztító készletet

Show More utasítások
elhárítása feldolgozása
1

Dolgozzon ki egy listát lépésből lekötés és az átalakulás. Hibaelhárítás bármely tudományos protokoll általában kezdődik, az utolsó lépés , a munka hátra. Matton 2

összehasonlítása tisztított DNS- terméket a mintát a kontroll DNS , a kitben . Miután a DNS-t és a klónozott transzformált baktériumokban , akkor lehet izolálni, és ellenőrizni, tisztítjuk agaróz gélelektroforézissel . Az eredmények elektroforézis jelezné, hogy átalakulás sikeres volt .
3

Határozza meg a baktériumok szaporodását közben klónozás . A legtöbb bakteriális vektorok kerülnek kialakításra, így csak azok a DNS- inszert - fog növekedni ampicillint tartalmazó táptalajon , vagy más antibiotikum. Gyenge növekedés lehetett megállapítani, hogy a DNS-minta nem volt sikeres helyezünk a vektorba. Matton 4

ellenőrizzük, hogy a ligált DNS- mintát tisztítottuk , a transzformáció előtt . Puffer sók és ligálást enzimek gátolja átalakulás a beillesztett DNS-t. Fontos az is , hogy meggyőződjön arról, hogy a ligálási enzimet hővel inaktiváljuk , befejezését követően a ligálási eljárást. Aktív ligáz esetleg zavarja átalakulás .
5

Ellenőrizze a dátumot bakteriális állomány használt átalakulás. Régi baktériumsejteket laza hatékonyságát az idő múlásával. Végül a bakteriális sejtek képtelenek a transzformáció és a minőség klónozás. Ha a folyamat az átalakulás már diagnosztizálták , akkor kezdődik elemzése lekötésével eljárás .
Hibaelhárítás Ligation
6

Ellenőrizze tisztaságát a DNS-minta előtt lekötés. Só a szennyező DNS-mintát eredményezhet szegény lekötés. A DNS-mintát kell lennie, és mentes a tisztított sók és enzimek , mielőtt azt használják ligáláshoz .
7

egyszer , hogy a DNS-szálak végeit ligálandó tompa vagy ragadós . Ligálás összekapcsolására használnak különálló szálak végeit tompa vagy ragadós végek követően kijelölt emésztés restrikciós enzimeket. T4 DNS ligáz enzim a választott tompa végű DNS-t -, de ez is működik a DNS ragadós végeket . Más DNS ligáz csak működik a DNS követően restrikciós emésztési létrehozni ragadós véget ér. Fontos, hogy használja a megfelelő DNS- ligáz a tesztelt. Matton 8

ellenőrzése DNS koncentrációját ligálás előtt mintát . DNS használata gyakran okoz magas koncentrációjú DNS lineáris válni . A készlet útmutató tájékoztatást nyújt a megfelelő mennyiségű DNS használni a ligációs .
9

Csere ligáz enzimet egy új tétel . Az enzimek különösen érzékeny , és szobahőmérsékleten folytatjuk fagyás - olvadás ciklusok . A ligáz megsérülhet követően számos felhasználási egyszerűen fagyasztással és túl sokszor. Egyes készletek javasoljuk, hogy ligáz lehet részekre osztjuk, kisebb adagokban az első használatnál , hogy csökkentsék a hányszor ez újra megfagy.
10

Ellenőrizze a lekötés kit. Gyakran a probléma a lekötés egy olyan készlet, amely már lejárt, vagy szennyezett más DNS és sók .