QuikChange Mutagenesis protokollok

QuikChange mutagenezis a márkanév egy készlet használt biotechnológiai kutatás , hogy rábírja a genetikai mutáció vagy DNS- változás . Agilent Technologies a cég mögött a terméket , amely két változatban kapható , QuikChange II QuikChange Lightning . Mindkét készlet tartalmaz egy puffer -oldat, a DNS-polimeráz enzim , színes reagensek , DNS- szekvenciák vagy primerek , és a sejt mintákban. Mutáns Strand Synthesis Reakció jegyzőkönyv Matton

Technikusok szintetizálnak oligonukleotidok vagy két rövid DNS- szekvencia , amely tartalmazza a kívánt mutációt . Aztán előkészíti a kontroll reakciót a DNS-szekvenciák , dNTP- keverék -oldat és DNS polimeráz enzim , hozzátéve, desztillált vízben. Később készítsen egy sor mintát reakciók alkalmazásával különböző koncentrációkban a kettős szálú DNS-t ( dsDNS ) , miközben a primer, illetve oligonukleotidok koncentrációja állandó , a gyártó utasításai szerint. Ezek tartsa a mintákat 203 ° F -on 30 másodpercig. A mintát tartalmazó DNS- szakasz két szám is tesztelve a hőmérséklet ciklikus , a technika, ahol a hőmérséklet változás a rövid ideig tartó idő . Végül a mintákat jégre helyeztük két percig.
Dpnl emésztése Az Amplification Termékek jegyzőkönyv Matton

Dpn I restrikciós enzim kivágja a DNS-t specifikus helyeken . Egy mikro - liter ilyen enzimet adunk közvetlenül az egyes amplifikációs reakció alatt a szokásos ásványi olaj segítségével overlay egy mikro- pipettával vagy specializált aeroszol -rezisztens pipetta hegyét. Azonban egy ásványi olaj overlay csak akkor szükséges , ha a termikus cycler , egy berendezést amplifikálására alkalmazott DNS-szegmensek , nem rendelkezik egy hot- szerelvény tetején . A reakció enyhén összekeverjük, majd később valósult meg a mikro- centrifuga egy percig. Ezt követően a mintákat inkubáltuk 98,6 ° F egy órán keresztül .
Átalakítása XL1 -Blue szuperkompetens Cells Protocol

XL1 -Blue egy tetraciklin ellenálló sejtvonal , hogy jön a QuikChange Mutagenezis készletek. Során ezt a protokollt , technikusok olvadás a sejtek, amelyek korábban tartott -112 ° F, a jégen. Aztán hozzá egy mikro- liter Dpnl a kezelt DNS-t, hogy melegítsük 107,6 ° F -on 45 másodpercig, és helyezzük a reakcióelegyet jégen két percig. Ezt az eljárást követően , technikusok hozzá készítmény NZY (kazein hidrolizátum és az élesztő extraktum) előmelegítjük 107,6 ° F és inkubáljuk egy órán át. A készítményt ezután fel agar gél lemezek és inkubáltuk 98,6 ° F 16 órán át.