A pepszin savas környezetben a leghatékonyabb, különösen 1,5 és 2,0 közötti pH-értéken. Ez a pH-tartomány a gyomorra jellemző a sósav jelenléte miatt. Ilyen savas körülmények között a pepszin olyan konformációs változásokon megy keresztül, amelyek aktiválják katalitikus helyét, lehetővé téve a fehérjékben lévő peptidkötések hatékony hasítását.
Ahogy a pH meghaladja az optimális tartományt, a pepszin aktivitása fokozatosan csökken. Ennek az az oka, hogy a magasabb pH változást okoz az enzim szerkezetében, ami csökkenti a szubsztráthoz való kötődést és csökkenti a katalitikus aktivitást. Ha a pH 4 fölé emelkedik, a pepszin nagyrészt inaktívvá válik.
A pepszin pH-függősége biztosítja, hogy elsősorban a gyomor savas környezetében aktív. Ahogy az étel bejut a gyomorba, a savas körülmények beindítják a pepszin szekrécióját, ami elindítja a fehérje emésztési folyamatát. Amint a táplálék átjut a vékonybélbe, a pH megnő, ami a pepszin denaturálódását és inaktiválódását okozza, és más enzimek veszik át az emésztési folyamatot.
Ezért a pepszin hatékonyságát valóban befolyásolja a pH, aktivitása a gyomor savas környezetében optimális.