Hogyan készítsünk antitest hígítást IHC

immunhisztokémiai ( IHC) egy speciális technikát használják a tudósok, hogy láthatóvá sejtek szöveteket , hogy kerültek a dia-és festettük a megfelelő antitest, amely felismeri a fehérje, amely egyedülálló a sejt vagy szövet alatt vizsgálatot. Antitest hígításokat ( titrálás ) , kell elvégezni, a kísérleti körülmények között meghatározott a felhasználó saját protokollt , nem az, hogy az antitest gyártójának , mivel a két nem lehet azonos. Ez az, amire szüksége van
sejtek festésére
antitest
hígító puffert ( " hígító " ),
Pipetták és tippek
mikrocentrifuga csőben
Aluminium fólia
Lab jelölők és a cső címkék
Ice
fénytől védett slide box

Show More utasítások
1

Ellenőrizze és előkészíti az antitest . Ellenőrizze, hogy az antitest szóba került a megfelelő fogadó , és reagál a pontos verzióját a fehérje (más néven az izoforma , vagy splice variáns) éppen tesztelt . Pipetta segítségével vegyünk 10 mikroliter része a és a címke a " személyi állomány" .

Ha csak nagyon kis mennyiségű antitest áll rendelkezésre , hagyja ki ezt a lépést.

Tartása személyi állomány az antitest rutin gyakorlat minden laboratóriumban , mert megakadályozza, hogy a kereszt-szennyezést az eredeti állomány . Adagoljunk ezt figyelembe egy könnyű védett mikrocentrifuga cső, vagy egy normális mikrocentrifuga csőbe , amelyet alumínium fóliába csomagoljuk , hogy megvédje a közvetlen fényt.

Tartsa ezt a csövet jégen , előnyösen egy esky egy légmentes fedéllel , ismét minimalizálása fény, amely képes elpusztítani az antitestet. Jegyezze az eredeti állomány koncentrációjú (pl. 100 egység per milliliter, 1 milligramm egy mikroliter , és így tovább), a cső, beleértve a nevét, az antitest és mit, ha van ilyen, a puffer úgy hígítjuk ( pl. szérum , sóoldat, vagy víz , stb.) Matton

2 Készítsük el a hígítási puffer , más néven az antitest hígítóval . Ellenőrizze, hogy ez összeegyeztethető az antitest és az immunhisztokémiai eljárást használják , például, hogy nem fedheti olyan fluoreszcens vagy gátolja ezt követő másodlagos antitesttel címkézés. Készítsen egy szabványos immunhisztokémiai hígítás (szintén a blokkoló puffer) összekeverésével 1X foszfáttal pufferolt sóoldat , 1 % Triton - X100, 10 % magzati borjú szérumot és 0,2% nátrium- azid .
3

titráljuk antitest. Az adott antitest koncentrációját a személyi állomány ( kifejezett koncentráció mikrogramm egységek, például egy mikroliter ) , meghatározza az ellenanyag térfogatával megszerzéséhez szükséges 10 mikrogramm antitest .

Állítsa be a hígítási sorozat pipettázással térfogatra egyenértékű 2 mikrogramm antitest ( pl. X mikroliter) , 100 mikroliter hígítószer és alaposan keverjük össze pipettázással fel és le. Ettől kezdve hígítás , hogy ugyanazt a X mikroliter és hozzáteszik, hogy a későbbi 100 mikroliter hígító . Ismételje meg ezt addig, amíg 8-10 hígítással ( vagy több ) áll össze .

Az utolsó cső ezért a legkisebb koncentráció , és a " telítő " koncentrációt , amely generálja a legmagasabb jelszintet a kísérlet során . Azonban az ideális koncentráció lesz valamivel töményebb , mint ez, úgy, hogy nem túl sok jelet állítanak elő, ami okozhat hibákat háttérben .

Címkézze a csöveket megfelelően az új hígított koncentrációban.