Hogyan kell felismerni NADH

Nicotinamide adenin dinuceltoide ( NADH ) , rövidítve " NAD ", egy koenzim található élő sejtek termel kémiai reakciók fehérjék. A gyógyszeripari vállalatok tanulmányozására , mert a NADH- anyagcsere folyamat , és szintetikusan hozza létre számos célra. Mivel a NADH mikroszkopikus , a szabad szemmel nem észrevenni azt. Meg kell a tudományos vizsgálatok és vizsgálati készletben érzékelni a jelenlétét. Ez az, amire szüksége van
Dry ice
Micro- centrifuga
Eppendorf csövekbe

Show More utasítások
Reagens Feloldás
1

kerékpáros puffer egy számlálót , és lehetővé teszi , hogy a puffert szobahőmérsékletre melegedjen. Az ideális hőmérséklet a puffer 22 Celsius fok .
2

Oldja fel a NAD kerékpáros enzim mix pontosan 220 ul kerékpározás puffer . Freeze a megoldás a hőmérséklet alatt -70 Celsius fok .
3

Oldja fel a NADH fejlesztő , 1,2 ml ddH2O . Óvatosan keverjük össze az oldatot , amíg teljesen fel nem oldódik. Ne örvény .
4

feloldandó NADH szabvány 200 mikroliter tiszta dimetil .
Mintaelőkészítés
5

Mossa a sejteket foszfáttal pufferolt sóoldatban. Matton 6

Pellet 2x10 ( 5) az egyes sejtek assay egy mikro- centrifugacső és fuss át 2000 RPM-nél 5 percig.
7

Kivonat a sejteket 400 mikroliter NAD /NADH extrakciós pufferben fagyasztással és a sejteket két ciklusban - 20 percig szárazjégen és 10 percen át szobahőmérsékleten. Vortex az extrahált sejtek pontosan 10 másodpercig. Matton 8

Spin a sejt mintákat egy mikro - centrifugában 14000 RPM-nél pontosan 5 percig. Matton

9 Transzfer a NAD /NADH sejtek egy tiszta csőbe .
vizsgálati protokoll
10

kell hígítani 10 mikroliter NADH szabvány 990 mikroliter NAD /NADH extrakciós pufferrel . Add 0, 2 , 4, 6 , 8, 10 mikroliter a hígított oldatot egy 96 - lyukú lemezen , hogy hozzon létre két példányban 0, 20 , 40, 60 80, 100 jól szabvány. Töltsük jól az utolsó 50 mikroliter az NAD /NADH- extrakciós pufferrel. Matton 11

Transzfer 50 mikroliter sejt az extrahált mintákat egy 96 lyukú lemez másolatok , mint korábban.
12.

Készítse elő a cella mintákat NADH felismerés . Lebomlanak a NAD a sejt által üzembe mintákból 200 mikroliter az extrahált mintákat sejt be Eppendorf csövekbe. Melegítsük fel a csöveket 60 Celsius fok pontosan 30 percen át egy szabályozott hőmérsékletű vízfürdőben . Gyorsan hűtsük le a mintákat helyezi a csöveket jégen . Spin a mintákat a mikro- centrifuga csapadékot eltávolítására . Transzfer 50 mikroliter a lebomlott minták egy 96 - lyukú lemezen párhuzamosban , mint korábban. Matton 13

Keverjük össze a NAD kerékpáros pufferrel keverjük össze 100 mikroliter NAD pufferrel keverjük össze, és a kerékpározás 2 mikroliter enzim NAD kerékpározást . Adjunk hozzá 100 mikroliter az új megoldás minden lyukba NADH standardok és minták. Matton 14

Inkubáljuk a lemezt szobahőmérsékleten pontosan 5 percig. Ez a folyamat konvertálja a NAD a NADH .
15

Adjunk hozzá 10 mikroliter NADH fejlesztő a minden is. Hagyjuk a lemezt , hogy üljön szobahőmérsékleten legalább 1 óra és legfeljebb 4 óra .
16

Olvassa el a lemezt, és kiszámítja a NADH .