Hogyan magatartási FRET Analitika

A fluoreszcencia rezonancia energia transzfer ( FRET ) egy vizsgálati technika mérésére használt jelenléte és mennyisége közötti kötődést két riporter -kapcsolt fehérjék. Ez a vizsgálat általánosan használt , hogy elemezze a potenciálisan kötő fehérjék a különböző típusú sejtek és hatékonyságának mérésére a konjugációs - típusú enzimek . Az érzékelő berendezés szükséges nagyban függ a fajta riporter molekulák használják , bár sokszor egy egyszerű 96 - lyukú lemez olvasóval lehet használni. Ez az, amire szüksége van
Protein-of-interest/Reporter molekula konstrukciók minden egyes vizsgált fehérje
96 - lyukú lemez blokk
96 - lyukú lemez leolvasó
Reakció pufferben (általában trisz- vagy foszfát - pufferelt - sós - alapú)
Konjugációs enzim ( ha szükséges)
Show More utasítások
Setup and Reading
1

generálása , vagy készítsen fúziós konstrukciók minden egyes fehérje érdekes , és amelyek mindegyike kapcsolódik egy fluoreszcens molekula - átvitel , mint például a zöld fluoreszcens fehérje ( GFP) , vagy bór - rodamin dipyrromethene ( BODIPY ) .
2

Határozzuk abszorbancia és emissziós hullámhossz mindegyik komponens és fluoreszcens a teljes vizsgálat . (Például , ha a vizsgálat azt méri GFP -> Rhodamine fluoreszcencia energia transzfer , a bemeneti -abszorpciós hullámhossz , hogy a GFP abszorbanciát ( 488 nm) , és az emissziós hullámhossz érzékelés az, hogy a rodamin ( 595 nm-en ) .)

3

létrehozása megfelelő reakció puffer a kísérlet , attól függően, az érdeklődés a proteinek azon biokémiai tulajdonságait. A TRIS- puffer - alapú gyakran használják , beleértve a kalcium-klorid és 0,05 százalék Tween -20 . Specifikus koncentrációk és komponensek lehet meghatározni keres naplókönyvelések részletező hasonló reakciók és állapotok .
4

Keverjük össze a két riporter -konjugált fehérjék az érdeklődés a különböző koncentrációban a reakció- pufferben , és alikvot 50-200 ul per lyuk . Hozzáadása a konjugációs enzim ( például szortáz ) mindegyik minta jól, ha helyénvaló. Ha végző végpont esszé , lehetővé inkubálás szobahőmérsékleten (vagy enzim optimális hőmérséklet) egy meghatározott ideig , majd olvassa be 96 lyukú lemez olvasó. Ha végez a kinetikai vizsgálat , folytassa közvetlenül olvasás ( lásd alább) .
5

Insert mintát lemezt a 96 lyukú plate olvasó. Hozzon létre egy új kísérletet oldalt , és elérheti a beállítások menüben. Adja meg a megfelelő abszorbancia ( gerjesztés) és emissziós hullámhossz , válassza ki a megfelelő kutak kell olvasni .

Ha végez a kinetikai kísérlet , állítsa be az időt - kísérlet során , valamint a mérési intervallum időszak (mint például egyszer 10 perc).

Kezdd el olvasni minta .

elemzése adatokat a Microsoft Excel ábrázolási funkció ( vagy valamilyen más program , mint például a GraphPad .)