Western-blot utasítások

Western-blot- analízis egy jól ismert technika a specifikus fehérjék azonosítására izolált szövetet. A különböző fehérjéket először elválasztott töltés és tömeg SDS- poliakrilamid gélen és átvisszük egy nitrocellulóz membránra . Transzfer után , jelzett antitestek specifikusan kötődnek a kívánt fehérje és a lefényképezett használatával röntgen film vagy láthatóvá fehérje -specifikus foltot. A végső eredmény azt mutatja, sötét sávok jelenlétére utal az azonosított fehérje. Cikkünk az alapvető módszertani végző Western blot analízis laboratóriumban képzett komplex protein kutatás. Ez az, amire szüksége van
SDS -poliakrilamid gélen ( SDS-PAGE) és elkülönített fehérjéket nitrocellulóz membránra

Desztillált víz
transzfer pufferben ( 30 g Tris-t, 144 g glicin és 200 ml metanolt tartalmazó 1 l- víz ) photo Szűrőpapír , Whatman 3 mm
Laboratóriumi szivacs
Western-blot transzfer kamrában
Labor tápegység Laboratóriumi
hűtőkocsi
Laboratóriumi keverővel
Tris- pufferolt sóoldattal ( TBS) ( 24,2 g trisz bázis , 80 g nátrium-kloridot 1 liter vízben ) photo Blokkoló oldat ( 5 százalék zsírmentes tejport tartalmazó TBS ) photo Elsődleges antitest oldatot
Címkézett antitest konjugátum oldatot
alkalikus foszfatáz szubsztrát oldatot nitro- kék tetrazolium folt
foszfát pufferelt sóoldat ( PBS)
Gel - képalkotó box

Show More utasítások
Transzfer fehérjéket nitrocellulóz membránra
1

Készítse elő a nitrocellulóz membránra . A membránt kell áztatni desztillált vízben két percig, majd helyezzük a transzfer pufferben , és hagyjuk ázni öt percig. Matton 2

összeszerelése átruházás szendvics álló szivacs /szűrőpapír /SDS- PAGE- /nitrocellulóz membrán /filter papír /szivacs . A szendvics van igazítva , így a membrán közelebb fekszik az anód és a gél közelebb a katód belsejében az átviteli kamrában.
3

hozzáadása transzfer pufferben a kamrában , így a szendvics elmerült. Helyezze a kamra belsejében a laboratórium hűtőszekrény . Átadása fehérje a gélt a membrán kell végezni 4 Celsius fok .
4

Állítsa be a tápegység át fehérjék a gélt a membrán . Az irány transzfer az anód felé jelzi a piros vezetéket . Nagyobb fehérjék gyorsabban válaszul egy elektromos áram fog mozogni , és az első. A tápegység szabályozza a sebességét transzfer. Állítsa be a hatalom, hogy 30 V és 40 mA egy éjszakai transzfer.
5

szétszerelni a tápegységet átvitel után befejeződött. Ne kapcsolatba az átviteli puffer vagy távolítsa el a szendvicset , miközben a tápegység csatlakoztatva van.
6

Vegye ki a membrán a szendvicset, és inkubáljuk két óra blokkoló oldatban . Fehérjék a blokkoló oldatban fogja elnyelni a membrán fehérjék , ahol nincs jelen van. Ez megakadályozza, hogy bármilyen antitest kötődését a membránhoz , ahol a kívánt fehérje nincs jelen .
Antitest kötődése a Matton 7

Inkubáljuk a nitrocellulóz membránt a primer antitest oldatot használ agitátor . A membránt kell teljesen elmerült az oldatban legalább egy órán keresztül. Ez elfogadható inkubáljuk egy éjszakán át.
8

mossa le a felületet alaposan , hogy távolítsa el a kötetlen antitestet . Négy különálló , 10 perces mosás TBS általában elegendő , hogy távolítsa el a felesleges antitest .
9

inkubáljuk a membrán jelölt antitesttel konjugált oldatot a keverővel. A membránt kell inkubáljuk egy legalább egy órán keresztül. A jelölt antitest konjugátum kötődik az alkalikus foszfatáz . Ez az antitest- enzim - keverék , amely felismeri és kötődik az első ellenanyag .
Kimutatása a Protein
10

Öblítsük le a membránt 10 percig PBS-ben négy alkalommal . Ez eltávolítja a maradék jelzett antitest konjugátum . Matton

Inkubáljuk 11 membrán alkalikus foszfatáz szubsztrát oldatot , amíg sávban minták jelennek meg. A festék a szubsztrát oldatot fogja megkötni az antitest-antigén - fehérje a membrán és a forma egy sötét színű sáv . A folyamat lehet azonnali vagy megkövetelheti, hogy 30 perc után a sávok figyelhetők meg .
12

Tekerjük a membrán teljesen celofánba , és tegyük közvetlenül a gél képalkotó megjeleníteni az eredményeket. A gél - képalkotó képes fotózni az eredmények megjelennek a Western blot membrán .