Krioprezerváció eljárások

Krioprezerváció eljárások azok, amelyek lehetővé teszik a sejtek tárolható korlátlan ideig használatával rendkívül hideg hőmérséklet , hogy függessze fel az anyagcsere tevékenységét. Két fő típusa mélyhűtés eljárások : egyensúlyi ( hagyományos lassú fagyasztás ) és a nem - egyensúlyi vagy ultra- gyors fagyasztás ( vitrifikáció ) . A kifejezés vitrifikáció származik a latin " üveges " vagy üveges . Mindkét eljárás használható védőanyagok fagyálló típusú tulajdonságokkal megelőzése sejtkárosodás során a fagyasztási folyamat . Miután a sejteket fagyasztva vagy üvegesített , tárolhatók korlátlan ideig merítjük őket a folyékony nitrogént, egy rendkívül hideg folyadék a hőmérséklet -196 C ( -321 F). Visszaállításához metabolikus aktivitás a sejt felolvasztás után , toxikus krioprotektív el kell távolítani a cella és a normál víz egyensúly fokozatosan helyreáll , mint a cella visszatért a normális működését hőmérsékletet. Áttekintés
áttekintése

Krioprezerváció eljárások azok, amelyek lehetővé teszik a sejtek tárolható korlátlan ideig használatával rendkívül hideg hőmérséklet , hogy függessze fel az anyagcsere tevékenységét. Két fő típusa mélyhűtés eljárások : egyensúlyi ( hagyományos lassú fagyasztás ) és a nem - egyensúlyi vagy ultra- gyors fagyasztás ( vitrifikáció ) . A kifejezés vitrifikáció származik a latin " üveges " vagy üveges . Mindkét eljárás használható védőanyagok fagyálló típusú tulajdonságokkal megelőzése sejtkárosodás során a fagyasztási folyamat . Miután a sejteket fagyasztva vagy üvegesített , tárolhatók korlátlan ideig merítjük őket a folyékony nitrogént, egy rendkívül hideg folyadék a hőmérséklet -196 C ( -321 F). Visszaállításához metabolikus aktivitás a sejt felolvasztás után , toxikus krioprotektív el kell távolítani a cella és a normál víz egyensúly fokozatosan helyreáll , mint a cella visszatért a normális működését hőmérsékletet.
Sejt- specifikus tényezők

az alkalmazott eljárás a sejtek vagy szövetek cryopreserve függ számos tényezőtől, beleértve a méret a sejt , a celluláris folyadék mennyiségét ( citoplazma ) és bonyolítja a cella ( vagy egyetlen sejt szövet). A sejteket egy nagy mennyiségű , mint a tojás citoplazma nehezebb , mint cryopreserve sejtek citoplazmájában csak maradék , mint spermiumokat. Krioprezerváció petefészek szövet is nagyobb kihívást jelent , mivel legalább három különböző típusú sejtek különböző méretű vannak jelen a petefészek-szövet , mindegyik különböző optimális fagyasztás igényeket. Lassú - fagyasztás protokollok már sikerrel alkalmazott különböző típusú sejtek . Vitrifikáció jelenleg a leghatékonyabb az egysejtű fagyasztás és kevésbé hatékony a szövetek , de a kutatás jelenleg is folyamatban van , hogy optimalizálja üvegesítésből szövetek .
Role védőanyagok

citoplazmájában egy cella vizet tartalmaz , amely bekapcsolja a jégkristályok a fagyasztási hőmérséklet . Amikor a jég képződik belsejében egy sejt , a cella aprított és meghal. Ezért a folyadék a cella el kell távolítani , mielőtt eléri fagyasztási hőmérsékletek elkerülése sejtkárosodást. Különböző típusú fagyálló ( fagyvédő ) folyadékok lehet használni, hogy a sejt dehidratálja fagyasztás előtt , beleértve a glicerin, propándiol, dimetil sulfoxde ( DMSO) , az etanol és a cukrok , mint a szacharóz és trehalóz. Az optimális hűtési sebessége (és felolvasztás ) függ a felhasznált fagyvédő típusától , valamint a jellemző a sejt vagy szövet legyen (vagy ez volt ), fagyasztva . Védőanyag mérgező az anyagcseréje sejtek olyan sejtek kitettség védőanyag a melegebb anyagcsere hőmérsékleten minimálisra kell csökkenteni vagy elkerülni. Felengedés után , vagy melegíti a sejtek krioprotektánsok teljesen el kell távolítani a cella előtt metabolikus aktivitása helyreáll .
Equilibrium Versus nem egyensúlyi Krioprezerváció eljárás

aránya fagyasztás attól függ, hogy a fagyasztás protokoll egyensúlyi vagy nem - equilbrium - alapú . Az egyensúlyi típusú eljárások , az optimális fagyasztási sebesség érhető el , ha van egy egyensúlyt a sebességet, amellyel a sejt kerül dehidratáljuk a víz és a sebességet, amellyel a víz a sejten kívül kerül átalakítani, hogy a jég szakaszban. Ezek az egyensúly vagy lassú - fagy protokollok rendszerint óráig is eltarthat , és a számítógép működtetéséhez használt programozható sebességgel fagyasztó , hogy a fagyasztás árak pontosan szükséges. Van általában egy "hold " lépést a protokoll mellett a kezdetektől , hogy a manuális létrehozására starter jégkristályok vagy a " vetés " a folyadékban a sejteken kívül .

üvegesítésből , egy teljesen más megközelítést , hogy a fagyasztás nem támaszkodik a rámpák és megvalósítása közötti egyensúly kiszáradás és jégkristály képződés használunk. Vitrifikáció olyan ultra- gyors, hogy nem áll rendelkezésre elegendő idő a jégképződés és a celluláris folyadék közvetlenül alakítjuk egy üveges fázisban , vagy üveg , károsodás nélkül, hogy a cellába. Programozható sebesség fagyasztók nincs szükség, mert a sejt közvetlenül belevetette magát a rendkívül hideg folyékony nitrogénnel , elérése pillanatnyi üveges állapotban .
Lassú Freeze eljárás

Az első lépés a a lassú fagyasztva eljárás az, hogy tegye , hogy a sejt egy védőanyag fokozatos lépésenként lassan egyensúlyba teszi a cellát a védőanyag , miközben felszabadító vizet. Miután a sejtek már kitisztult a legtöbb celluláris vizet, a sejtek a védőanyag folyadékot helyezünk egy tartályba valamilyen, például egy műanyag szalma, üveg vagy műanyag ampulla ampullából térfogatú folyadék körülvevő sejtek lassú fagyasztás általában kisebb, mint egy teáskanál , és csak néhány csepp. Az előre jelzett tartályba töltjük , lezárjuk , és tegye egy programozható fagyasztó, amely lassan csökken a hőmérséklet a tartály alatt perc vagy óra a nagyon alacsony hőmérsékleten. Néhány perc múlva a hűtés , önindító jégkristályok kell kialakítani a tartály belsejében a " vetés " a tartályba. Vetés végzi egy eszköz segítségével (például csipesszel ), amelyek már előre hűtött folyékony nitrogénben , hogy megérintse a tartályba, és jégkristály képződés okozhatnak . Ez a kezdő kristály kezdeményez kontrollos jégkristály képződés egy helyben, biztonságosan távol a sejteket. Vetés Miután befejeződött, a többi a hűtési rámpák folytathatja . Amikor a hőmérséklet eléri a tartály között -30 és -85 C-on, a tartály tartja a sejteket lehet belevetette közvetlenül folyékony nitrogénbe befejezni a -196 C-on való hűtés
Vitrifikáció
Ultra- gyors

nem egyensúlyi eljárások, mint például hűtés vitrifikációs nagyobb koncentrációi alkalmazhatóak krioprotektív párosul egy szinte pillanatnyi sebesség érhető el, fagyasztás lezúduló sejtek közvetlenül folyékony nitrogénben. Vitrifikáció megkerüli a jég - kristály fázis képződését , és mozgatja a vizet közvetlenül a pohár -szerű fázis . Vitrifikáció végpontot ér el , mint az azonos fagyasztás lassú , de ütemben -3000C/min képest 10C/min , vagy több. A vitrifikációs sejteket általában helyezni a csúcsa a szalma és a felesleges védőanyag eltávolítjuk , így csak annyira, hogy a sejt kapaszkodik a tartály által felületi feszültség előtt lezúduló folyékony nitrogénben. Mivel olyan gyors fagyasztás , az expozíció időtartamát krioprotektív sokkal kevesebb, és sokkal nagyobb koncentrációban lehet krioprotektív tolerálja a cellába. Melegítő a sejt , hogy küldje vissza a normális anyagcsere működéséhez is hihetetlenül gyors . Kezelése üvegesített minták sokkal igényesebb , mint a lassú , fagyasztott mintákat , mert még a rövid idejű expozíció feletti hőmérsékleten , amely a folyékony nitrogén lehet kezdeni a nem kívánt felmelegedés folyamatát és újrafagyása , ami hátrányos a cellába.