Molekuláris klónozása protokollok

Molekuláris klónozás protokollokat magába alkalmazott eljárások meghatározására , izolálása és lemásolják a DNS-szekvencia . A hagyományos restrikciós és ligálási klónozási protokollok kezdeményez DNS fragmentáció korlátozott endonukleázokkal ( enzimek, amelyek a DNS-szálakat vágott restrikciós helyeket ), a DNS -fragmens ligálási ( a javítás a folytonossági DNS molekulák) , transzfekcióval ( bevezetése a nukleinsav sejtbe test ) és kiválasztási ( a választott egyes genomok replikáció) . Izolálása

jegyzőkönyvek izolálására egy DNS-fragmenst , az első lépés a molekuláris klónozás , gyakran bele egy polimeráz láncreakció ( PMR) , amely felhasználja ciklusok fűtési és hűtési amplifikálására DNS- darab . Ahhoz, hogy elérjük a célt sorrend méret, más protokollok DNS ultrahangos , reakció enzimes emésztés és a kémiailag szintetizált oligonukleotid . Ezek a protokollok befolyásolhatják az összeg nagyságát és az izolált DNS-t szükség.
Ligálása

ligáláshoz jegyzőkönyvek felhasználásával járnak egy enzim , a DNS- ligáz , DNS-molekulák , hogy csatlakozzon együtt kovalens kötés. Jegyzőkönyv diktálja kombinálásával DNS-fragmentumokat , a klónozó vektor egy ligációs puffert , a DNS- ligázt és sterilizált vizet egy mikrocentrifuga csőbe , és inkubáljuk egy éjszakán át 4 Celsius fok .
Transzfekció

protokollok transzfekció vagy infúzió egy sejt DNS-nek egy nem - virális eszközzel, DNS-t az intravénás gyakran járnak közvetlenül a sejt citoplazmájába . Más módszerek közé tartozik a kémiai reagensek , mint például a kalcium-foszfát és a lipidek, a transzfekciós szállít komplex a sejtmembránon keresztül . Ez a módszer teszteli hatását génmódosítás működéséről szóló specifikus gének .
Selection

kiválasztása , vagy szűrés, protokoll meghatározza, hogy mely sejtek sikeresen tartotta a DNS- betét , és jelzi amely a sejtek szükséges szigetelés . Egy centrifuga termés sejtek , amelyek tartalmazzák a transzfektált DNS-t, amelyeket ezután inkubáljuk lizozim (a természetben előforduló enzim) pufferrel kezeljük , és egy lúgos tisztítószerrel, amely a fehérjék és membránok oldhatóság . Használata acetátból kicsapjuk a fehérjéket , és a centrifuga cheesecloth szűrjük le a DNS-t tartalmazó felülúszót ( az oldható folyékony maradék egy centrifugáltuk vegyület) . A felülúszót polietilénglikollal kicsapjuk , centrifugáljuk , és felfüggesztette egy cézium- klorid- etidium -bromid és a pufferben. Az etidium -bromidot foltok a sűrűség szerinti DNS , és egy hosszú hullámú UV- fény, az alsó sáv - DNS-t extraháljuk öt cc fecskendőt . Egy ekvilibrált oszlopon ioncserélő elválasztja a DNS-t az etidium- bromidot és cézium -kloridot , és a végső DNS üledéket szuszpendáljuk pufferoldatban és kimutatható agaróz gélelektroforézissel .